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“上海恒远“文献:静电纺丝纳米纤维的制备及其蛋白药物缓释体系

点击次数:63 发布时间:2019/8/30
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静电纺丝纳米纤维的制备及其蛋白药物缓释体系
顾珊珊,张寒莹,朱嗣文,吴 飞,金 拓*
(上海交通大学药学院,上海 200240)

摘要 :细胞因子蛋白复杂脆弱的高级构象极易因组织工程支架制备过程中的苛刻条件变性而失活,甚至引起有害的抗体反应。目前有关组织工程支架材料的研究方法尚未实现以天然构象长期缓释细胞因子蛋白。针对这个难题,本研究运用水相 - 水相冷冻相分离蛋白颗粒制备法,将蛋白药物血管内皮生长因子 (VEGF165) 保护性载入葡聚糖纳米颗粒中,进而将载有蛋白的多糖颗粒混悬于作为缓释基质的聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 中,通过高压静电纺丝,制得长效缓释VEGF165 的组织工程纤维膜。一系列物理化学表征,包括扫描电镜 (SEM)、接触角、强度试验等,表明上述方法制得了表面形态与机械强度较理想的组织工程纤维。对制备过程中各个阶段的蛋白进行回收,并采用 CCK-8 法进行活性检测证明 VEGF165 的生物活性在多糖颗粒制备阶段保持在 97%以上,在最终的组织工程纤维膜阶段保持在 87%以上,远大于w/o 型乳液法制备得到的纤维 ( 低于 55% )。体外试验证明颗粒复合纤维能抑制蛋白突释且达到长效缓释效果,蛋白在初始 5 d 内的释放总量不到 35%,到 25 d 时释放量超过 92%。而 w/o 型乳液法制得的纤维在初始 5 d 内的释放总量超过53.12%,到 25 d 时释放量为 84.52%。最后将纤维膜植入下肢缺血的大鼠体内,进行免疫组化观察,结果表明颗粒复合PLGA 纤维的再生血管数量明显高于 w/o 型乳液法制备得到的纤维。
关键词:静电纺丝;蛋白;缓释;血管内皮生长因子;血管再生
中图分类号:R944.9 文献标志码:A 文章编号:1001-8255(2017)09-1325-07
静电纺丝技术是一种纤维制造工艺,在高压电场的作用下,聚合物溶液或熔体进行喷射纺丝,一般所得的纳米纤维直径在 2 nm 到几微米之间 [1]。静电纺丝纤维具有类似细胞外基质 (extracellular matrix,ECM) 的三维网状结构,能较好地模拟天然 ECM,从而提供细胞生长所需的微环境,在组织工程支架制备方面具有独特的优势 [2]。聚乳酸 -羟基乙酸共聚物 (PLGA) 是人工合成的高分子材料,具有良好的机械性,可加工成管状支架结构,生物相容性好并可完全降解,因而成为组织工程材料中研究应用最广的支架材料 [3]。细胞因子蛋白复杂脆弱的高级构象极易因组织工程支架制备过程中的苛刻条件变性而失活,甚至引起有害的抗体反应。目前有关组织工程支架材料的研究方法尚未实现以天然构象长期缓释细胞因子蛋白。并且,有关载有生物活性因子的静电纺丝组织工程支架的制备方法中,普遍存在蛋白药物的体外突释严重,蛋白药物容易受到水油界面影响而变性失活,达不到理想的缓释效果。本课题通过前期发明的无油水界面的水相 - 水相冷冻相分离方法 [4],根据热力学分配原理将血管内皮生长因子 (VEGF165) 包裹至葡聚糖 (DEX)纳米颗粒中采用静电纺丝的技术,巧妙地将VEGF165-DEX 纳米颗粒与 PLGA 高聚物溶液混合,制得担载 VEGF165-DEX 纳米颗粒的 PLGA 纳米纤维膜,并对纤维膜的表观形态和物理性质进行测定,同时利用 CCK-8 法考察了在纤维和颗粒制备过程中蛋白的活性变化,ELISA 试剂盒检测体外释放过程中蛋白的缓释效果,此外还构建了大鼠下肢缺血模型,考察纳米纤维膜的治疗效果。
1 仪器与试药
ss-2534H 型静电纺丝仪 ( 北京永康乐业科技有限公司);S-4800 型扫描电镜 ( 日本 Hitachi 公司 ) ;Alpha1-4型冷冻干燥机 ( 德国 Christ 公司 ) ;MK3 型酶标仪 ( 芬兰Thermo Labsystem 公司 ) ;Instron5543 型生物力学测试机( 英国特朗公司 ) ;OCA20 型视频光学接触角测量仪 ( 德国Dataphysics 公司 ) ;Eclipse 倒置荧光显微镜 ( 日本尼康公司);PM33GT-17 型压汞仪 ( 美国 Quantachrome 公司 )。PLGA(75/25,MW 66 000 ~ 107 000,美国 Lakeshore Biomaterials 公司 ) ;小鼠血管内皮细胞生长因子 (murine VEGF165,型号 450-32) 和 murine VEGF ELISA kit( 型号900-K99)( 美国 PeproTech 公司 ) ;牛血清白蛋白 (BSA,进口分装,上海思吉生物有限公司 ) ;0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液 (PBS,pH 7.4,赛默飞世尔生物化学制品有限公司 ) ;CCK-8 试剂盒 ( 日本同仁化学研究所 ) ;DEX(MW 64 000 ~76 000) 和聚乙二醇 6000(PEG 6000) ( 美国 Sigma 公司 ) ;N,N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、二氯甲烷和Span-80( 化学纯 ) 均购自国药集团化学试剂有限公司 ;水合氯醛 ( 上海恒远生物科技有限公司 ) ;多聚甲醛、山羊抗鼠 CD31、RP 标记的兔抗山羊均购自于谷歌生物上海实验服务中心。人脐静脉内皮细胞 (HUVECs,中国科学院细胞库 )。Wistar 大鼠 ( 雄性,170 g,上海杰思捷实验动物有限公司,合格证编号 2015000511432)。

 

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