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恒远告诉您:细菌转化的操作步骤
点击次数:797 发布时间:2017-10-20

细菌转化
 

操作步骤
 

(1)事先将恒温水浴的温度调到42℃。
 

2)从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100μl)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10min。

 

(3) 加入5μl连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng),轻轻震荡后放置冰上20min。
 

(4) 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5min。
 

(5) 在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.
 

(6) 在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂)。
 

(7) 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
 

(8) 在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
 

(9) 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。
 

(10)观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
 

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