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干货:ELISA实验经验总结
点击次数:115 发布时间:2019-08-22

    ELISA试剂盒在操作过程中总是会出现或大或小的问题,比如说花板、假阳性、全显色、信号值比空白还低等等。我司技术人员为大家总结经验了!

    以下是做ELISA试剂盒的经验总结:

    一、包被原
    包被原的性质很重要,蛋白浓度,是否降解,这关系到做出的抗体可不可以被其识别,所以保存抗原很重要,做重组蛋白时,一定要在冰浴下缓慢融化。还有有的包被原可能不是蛋白,对于生物素和脂类物质或小分子物质要事先对其改造再加以包被。

    方法简要的列出如下:
    ①亲和素生物素:先亲和素先包被载体,加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于。
    ②脂类物质:可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。
    ③小分子必须依靠和大的蛋白载体偶联后才能固定在固相载体上。

    二、包被液的选择
    一般选择ph9.6的碳酸盐缓冲液。但有时由于实验的需要,包被原的特殊性也可能采用中性的缓冲溶液来包。

    应注意以下原理:ELISA试剂盒由于蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用,这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响,大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。具体的实验还要有坚固的理论外也要实践,看一下zui终可不可以应用到自己实验当中去。常用的包被液除了刚才提到的pH9.6碳酸盐缓冲液,还有pH7.2的磷酸盐缓冲液和pH7-8的Tris-HCL缓冲液等等。

    三、封闭
    继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉,可以高浓度使用(5%-10%);还有一些稀有用到的各种动物血清 (主要为了排除相似蛋白干扰)和酪蛋白等等。但zui终选用什么,要依据实验具体来实践。

    四、洗涤板
    可以说在ELISA试剂盒操作中,洗涤是zui主要的关键技术。因为聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,为达到分离游离的和结合的酶标记物的目的,清除残留在板孔中游离的物质,以及非特异性地吸附的干扰物质,在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。所以在洗板时会有一定误差,人为因素很大(当然有条件的用洗板机除外),洗的不彻底或串了孔,对如此灵敏的ELISA试剂盒系统可是不小的影响。

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