ELISA 是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子等领域。

一、原理

    PCRELISA是用免疫学方法检测PCR产物，这比常规用电泳方法及Southernblot要简便、省时，可同时处理大量标本，便于自动化。PCR-ELISA的原理是在做PCR扩增时应用生物素（biotin）标记的引物，这样PCR的产物就可结合到亲和素（avidin）包被的塑料板上，再用地高辛标记的探针与PCR产物杂交，然后就可以用抗地高辛的酶联反应检测。

 

二、材料、方法和结果

    1.PCR扩增按基本PCR技术做DNA扩增，只是所用的引物至少有一个是5′端用生物素标记的。通常可在DNA合成仪上直接合成5′端带生物素标记的引物。

    2地高辛标记的探针杂交将地高辛标记的DNA探针01μg稀释于90μl 50mmol/L TrisHCl,pH值83,80mmol/L KCl中。取10μl PCR产物加到管中，加热至90℃，缓慢冷却至67℃。离心1s，置52℃水浴保温1h。

3将杂交产物固定到塑料板上①可用商品供应的亲和素包被的酶标板，亦可用普通酶标板按常规方法将亲和素包被上；②每孔加100μl封闭液（含10mg/ml BSA,1mg/ml鱼精DNA的PBS），室温1h；③PBST洗3次；④将地高辛探针杂交的PCR产物直接加到酶标板上，室温孵育1h；⑤PBST洗3次。

4ELISA检测①将抗地高辛抗体稀释于PBS中，每孔加100μl，室温孵育1h；②PBST洗3次；③将酶标的第二抗体稀释于PBS中，每孔加100μl，室温孵育1h；④PBST洗3次；⑤每孔加100μl酶底物，在颜色适合后终止反应；⑥在酶标仪上读结果。

 

三、注意事项

    本法的敏感性可与放射性同位素标记相比，但又避免了同位素的危险。做大量样品时，应统一配制反应液，再小心地分装到各反应管中，以免污染，并使各管条件一致。非特异性反应常由于地高辛标记的DNA探针与酶标板直接结合所致，因此在封闭液中一定要包括足量的鱼精DNA。