温育是ELISA测定中影响测定成败zui为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原*结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。zui为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。
温育这一步是ELISA测定中zui容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟～1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1～2小时才能有较*的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。
除有的ELISA试剂盒仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA检测试剂盒板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。
若用保温箱，试剂盒应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，zui后将ELISA试剂盒板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。ELISA检测试剂盒属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。ELISA试剂盒以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有zui贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。
这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20～25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，试剂盒只要平置于操作台上即可。ELISA检测试剂盒应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，在一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
