双抗夹心ELISA法是指讲特异性针对代测抗原的抗体包被于96孔微孔板中，制成固体载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中代测抗原连接于固相载体的抗体结合，然后加入生物素化的针对代测抗原的抗体，形成夹心，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次*洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下，转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测抗体原正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（O.D.值），用于样本中待测抗原浓度测算。

1.材料与仪器

（1） 包被缓冲液 （pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液）

（2）洗涤缓冲液 （pH 7.4，0.15 M PBS）

（3）稀释液

（4）终止液（2 M H2SO4）

（5）底物缓冲液 （pH 5.0）

（6）四甲基联苯胺（TMB）使用液

（7）2，2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液

（8）抗原、抗体和酶标记抗体：按说明书处理。

（9）标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液。

（10）96 孔聚苯乙烯塑料板 （酶标板）。

2.步骤

⑴将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

⑵加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

⑶加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。*洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

⑷加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。